In KT 323 befindet sich der Vorbereitungsraum der Biochemie sowie ein großer Teil der Ausstattung zur Proteinexpression und -isolierung.

Um Proteine, z.B. Enzyme, die eine bestimmte Reaktion katalysieren, herzustellen, können diese aus einer natürlichen Quelle (Mikroorganismen/Pflanzen/Gewebe) extrahiert werden. Eine andere Möglichkeit stellt die so genannte heterologe Expression dar. Dafür wird das Gen für das Protein in einen anderen Organismus transferiert und das Protein dort produziert. Mikroorganismen wie E. coli oder einzellige Pilze eignen sich besonders für diesen Zweck.  

Nach der Anzucht werden die Zellen der proteinproduzierenden Bakterien oder Hefen zerstört und die Proteine über chromatographische Methoden gereinigt.

Proteinreinigung durch Niederdruck-LC

Zur Proteinreinigung werden heute vor allem chromatographische Verfahren verwendet. Im Labor für Biochemie kommen zwei Niederdruck-Flüssigchromatographiesysteme zum Einsatz. Hier können mit geringem apparativen Aufwand wichtige Trennungen wie Affinitäts-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie durchgeführt werden. Bei der Untersuchung empfindlicher Proben werden die gesamten Systeme bei 4° C betrieben.

Proteinextrakte, z.B. von Kulturen, die heterologe Proteine exprimieren, werden auf die jeweils benötigten Säulen aufgetragen. Die gewünschten Proteine binden, Verunreinigungen laufen durch die Säule. Schließlich werden die gesuchten Proteine in angereicherter Form von der Säule gelöst (eluiert). Die eluierten Proteine werden automatisch in Fraktionen gesammelt. In diesen Protein-fraktionen wird anschließend der Gehalt an gesuchtem Protein bestimmt, z.B. durch Aktivitätstests, SDS-Page oder Western Blot.

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Um die Zusammensetzung von Proteinextrakten oder Fraktionen aus der Protein-Chromatographie zu untersuchen, werden Proben davon auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen und in Gegenwart des starken Detergens SDS durch Elektrophorese getrennt. Durch die Bindung des SDS sind dann alle Proteine stark negativ geladen und wandern im elektrischen Feld zum Pluspol. Das Gel aus Polyacrylamid bewirkt, dass kleine Proteine schneller wandern als große. Durch Vergleich mit Proteinen bekannter Größe kann daher das Molgewicht der enthaltenen Proteine ungefähr bestimmt werden.

HPLC

Durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) werden im Labor für Biochemie vor allem Proben mit kleinen Molekülen im analytischen Maßstab untersucht. Hauptsächlich verwenden wir Umkehrphasen (RP)-Chromatographie an C18-Säulenmaterial. Je hydrophober eine Substanz ist, desto besser bindet Sie an dieses hydrophobe Material. Durch kontinuierliche Erhöhung des hydrophoben Anteils im Laufmittel (meist Acetonitril in Wasser) wird dann die Elutionskraft der flüssigen Phase erhöht und die hydrophoberen Verbindungen werden nach und nach wieder von der Säule gelöst. Eluierte Substanzen werden durch Messung der Absorption in einem Diodenarray-Detektor quantifiziert.

Falls nötig, kann die HPLC -nach Auswechseln der Pumpenköpfe und Anschluss eines Fraktionssammlers- auch im präparativen Maßstab betrieben werden.