Detektion und Quantifizierung von Proteinen - Western Blot

Was hat ein Löschpapier (engl. blotting paper) mit der Bioanalytik gemeinsam? Beim Aufsaugen der überflüssigen Tinte entsteht ein identischer Abdruck des Originals und genau dies wird mit dem "Western Blot" ebenfalls erreicht - nur nicht von Tinte, sondern von aufgetrennten einzelnen Proteinen.

Die Methode wurde 1979 von J.Renart [1] entwickelt (von W.N. Burnette "Western Blot" getauft) und von H. Towbin [2] in der heute häufig verwendeten Form optimiert. Nach dem Transfer der Proteine können diese unspezifisch (z.B. mit Ponceau-Rot) oder spezifisch (Immundetektion) angefärbt werden. Bei letzterem wird das Antigen-Antikörper-Bindungs-Prinzip ausgenutzt, um mit Hilfe spezifischer Antikörper-Konjugate einen Nachweis zu erlangen.

Diese Konjugate sind gekoppelt mit einem Enzym, häufig Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase, oder einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. FITC = Fluorescein-Isothiocyanat). Ebenfalls möglich ist die radioaktive Markierung des Antikörpers. Bei Verwendung der Meerrettichperoxidase erfolgt eine Zugabe von Substrat, entweder Luminol für eine Chemilumineszenzreaktion oder 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin, das einen blauen Farbkomplex bildet. Wird Luminol verwendet, so lässt sich die Chemilumineszenz mittels eines geeigneten Scanners (C-Digit, Li-Cor) erfassen und die Proteinmenge quantifizieren.

 Bild 1: oben: SDS-PAGE
            unten: Messung des Blots mit C-DiGit Blotscanner von Li-Cor.

 Bild 2: Vergleich unspezifische und spezifische Proteinfärbung
            a) Färbung der Membran nach Blot mit Ponceau S
            b) Färbung der Membran mit Antikörpern (1. AK Protein-L-Biotin, 2. AK Streptavidin-POD)

Literatur zum Nachlesen:

[1] Renart, J. et al. (1979): Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Bd. 76, S. 3116-3120. PMID 91164.

[2] Harry Towbin, Theophil Staehelin, Julian Gordon: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Bd. 76, Nr. 9, 1979, S. 4350–4354, PMID 388439, PMC 411572

Gewinnung rekombinanter DNA zur Klonierung - PCR

Auf Basis der grundlegenden Eigenschaften der PCR (wie auch auf den Seiten der Biocheme erläutert), wird in der analytischen Biochemie dieser "DNA-Kopierer" zur Erzeugung von rekombinanter DNA für Plasmide und zum Nachweis erfolgreicher Transformationen in Kombination mit einer Agarose-Gelelektrophorese verwendet.

Für den ersteren Fall wird klassisch aus einem vorhandenen Plasmid ein Teilbereich der DNA vervielfältigt, das gewonnene, aufgereinigte PCR-Produkt in einen zuvor geschnittenen Vektor ligiert und das so generierte neue Plasmid in Bakterienzellen transformiert. Eine erfolgreiche Transformation kann über Selektionsmedien nachgewiesen werden, aber auch über eine erneute PCR. Der Vorteil der PCR ist, dass sie auch nachweisen kann, ob das gewünschte Plasmid und das zuvor ligierte DNA-Fragment ohne Veränderungen von den Bakterien aufgenommen wurden. Die PCR kann als sogenannte Kolonie-PCR durchgeführt werden, dabei werden Kolonien von der bewachsenen Petrischale mittels eines sterilen Zahnstochers "gepickt" und direkt in den Reaktionsansatz gegeben, aber auch der klassische Weg über Plasmidextraktion mit anschließender PCR ist möglich. Nach der PCR erfolgt noch eine Agarose-Gelelektrophorese, um die Länge der DNA-Fragmente bestimmen zu können.

Bild 1: links: PCR-Gerät von Bio-Rad
           rechts: Agarosegelelektrophorese-Kammer mit Netzgerät (Bio-Rad)

Bild 2: links: Transilluminator mit Dunkelhaube zur Betrachtung von Agarosegelen
           rechts: offene Dunkelhaube mit Blick auf Transilluminator, fluoreszierende Banden zeigen
                       DNA 

Reinigung von Proteinen - LC Äkta

Auch bei der Aufreinigung von exprimierten Proteinen aus Bakterienkulturen und zur Analytik von Proteingemischen kommen Methoden der analytischen Biochemie zur Anwendung. Die Niedrigdruck-LC-Methode stellt hierbei die am häufigsten angewandte Methode dar (siehe auch Labor für Biochemie). Im Labor für analytische Biochemie steht ein vollständig temperierbares ÄKTA-System zur Verfügung. Je nach Anforderung können hier Säulen für Affinitätschromatographie (z.B. zur His-Tag-Aufreinigung), Ionenaustausch- (IC) oder Größenausschlusschromatographie (=SEC, Gelfiltration) verwendet werden.

Weitere Immunoassays - ELISA, Immundiffusion

Neben des bereits aufgeführten Western Blots und anderen Immunoassays wird im Labor für analytische Biochemie auch der ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) sowie die Immundiffusionsmethode angewandt. Diese Methoden dienen ebenfalls zum Nachweis bzw. der Quantifizierung von Antigenen oder Antikörper.

Eine Variante des ELISAs stellt der Sandwich-ELISA dar. Zunächst wird ein Antikörper, der gegen ein Epitop des zu untersuchenden Antigens gerichtet ist, in einer Multiwellplatte immobilisiert. Dann wird das zu analysierende Antigen hinzugegeben, mehrere Waschschritte durchlaufen und mit einem Zweitantikörper, der ebenfalls gegen das Antigen, aber ein anderes Epitop gerichtet ist, erneut inkubiert. Durch diesen Aufbau ähnelt das Konstrukt einem Sandwich. Der Zweitantikörper, auch Detektionsantikörper genannt, ist wiederrum radioaktiv oder mit einem Enzym oder einem Fluoreszenzfarbstoff markiert (siehe Western Blot). Durch geeignete Gerätschaften kann das gesamte System automatisiert werden. Im Labor für analytische Biochemie befindet sich zur Automation der Waschschritte ein sogenannter Washer (Tecan), bevor mit Hilfe eines Plattenphotometers (Tecan Sunrise) der Gehalt an Antigen bestimmt wird.

Auch bei der Immundiffusion gibt es verschiedene Varianten. Im Immunchemie-Praktikum werden die verschiedenen Arten angewandt und bewertet. Einfach radiale Immundiffusionstests erlauben ebenfalls eine quantitative Aussage über vorhandene Antigene. Wenn allerdings die Fragestellung lautet: Sind Ratten, Rinder, Pferde und Schweine mit Kaninchen verwandt? Zumindest die immunologische Verwandtschaft zweier Antigene lässt sich mit der doppelt-radialen Immundiffusion nach Ouchterlony feststellen. In eine Petrischale mit Agar werden hierbei kleine Löcher gestanzt und in diese die zu untersuchenden Antigene sowie in die Mitte der entsprechende Antikörper pipettiert. Anhand der gebildeten Präzipitationslinien lässt sich die immunologische Verwandtschaft schließlich feststellen.

 Bild 1: Doppeltradiale Immundiffusion nach Ouchterlony

 Bild 2: Einfachradiale Immundiffusion nach Mancini