Hintergrundinformation zu SARS-CoV-2 und zu dessen Nachweis

Hier möchten wir Ihnen einen Überblick über Informationsseiten zur aktuellen Lage zu SARS-CoV-2 geben und die Grundlagen zum Nachweis des Erregers kurz darlegen. Diese Informationen sind nicht nur für Studierende der Studienrichtung Biochemie interessant.

(zuletzt aktualisiert: 12.07.2020, R. Lösel)

Auf den Webseiten des Robert-Koch-Instituts (RKI) können Sie täglich aktualisierte Fallzahlen in Deutschland, auf dem Server der WHO die Fallzahlen weltweit abrufen. Möglicherweise aktueller sind die Zahlen der Johns Hopkins Universität, die andere Datenquellen auswertet. Inzwischen ist eine erste Fassung der sog. Heinsberg-Studie aus der Arbeitsgruppe Streeck erschienen, die die Zahl der Infizierten in einer stark betroffenen Gemeinde nach einer Karnevalsveranstaltung untersucht. Die Ergebnisse sind jedoch nicht ohne Weiteres auf andere Situationen übertragbar.

Einen Steckbrief der Krankhreit COVID-19 und des Erregers SARS-CoV-2 finden Sie hier (Webseite des RKI). Die WHO hat zur Aufklärung häufig verbreiteter Falschmeldungen zu COVID-19 eine eigene Seite (Myth Buster) angelegt. Hinweise zum Schutz vor Infektionen finden Sie auch auf den Seiten der BZgA. Inzwischen deuten erste Ergebnisse darauf hin, dass man einen schweren Krankheitsverlauf labordiagnostisch vorhersagen kann.

Tagesaktuelle Daten zur Entwicklung der Reproduktionszahl R auf der Basis des Nowcastings sowie die Erklärung der Modelle sind ebenfalls auf den Seiten des RKI zu finden.

Der Nachweis des Erregers erfolgt in den meisten Ländern nach einer PCR-Methode, die von der WHO empfohlen wird und sich an eine ältere Methode zum Nachweis des Erregers von SARS (ebenfalls ein Coronavirus) anlehnt.

Hierbei handelt es sich um PCR Methoden, die die 5‘-Nukleaseaktivität der Taq-Polymerase ausnutzen, um eine (an die Zielsequenz hybridisierte) gequenchte Oligonukleotid-Sonde abzubauen. Durch die Struktur der Sonden (Fluoreszenzfarbstoff an einem Ende, Quencher am anderen Ende) wird die Fluoreszenz des Farbstoffs durch den Quencher gelöscht, solange beide durch das Oligonukleotid in enger Nachbarschaft gehalten werden. Sobald das Oligonukleotid durch die 5‘-Nukleaseaktivität der Polymerase bei der Neusynthese eines DNA-Strangs abgebaut wird und Fluoreszenzfarbstoff und Quencher voneinander weg diffundieren, findet diese Fluoreszenzlöschung nicht mehr statt. Die Intensität der Fluoreszenz ist ein direktes Maß für die Menge an neugebildetem DNA-Amplifikat. Ein ähnlicher Versuch ist der Modellversuch Real Time PCR (nur über das Hochschulnetz/VPN aufrufbar) im Praktikum Diagnostik und Forensik.

Die Auswertung der erhaltenen Fluoreszenzkurven ist z.B. hier beschrieben.

Coronaviren sind mittelgroße (+)-Strang RNA-Viren, die normalerweise Erkältungskrankheiten verursachen. Mehr zur Struktur und zur Replikation hier.  Allgemeines zu Viren und deren molekularen Eigenschaften finden Sie in diesem E-Book (nur über Hochschulnetz/VPN). Eine Darstellung der bisher gefundenen Mutationen des Virus sowie daraus errechnete Modelle der globalen Verbreitung ist hier verfügbar.

 

Antikörper-Tests

Der Nachweis von Antikörpern gegen SARS-CoV2 ersetzt nicht den direkten Nachweis mittels PCR. Antikörper werden erst als Reaktion des Immunsystems auf die Infektion mit einigen Tagen Verzögerung gebildet. Das Auftreten von Antikörpern gegen einen Erreger zeigt also häufig an, dass die Infektion überwunden ist (Serokonversion). Es ist aber gegenwärtig unklar, wie lange bei SARS-CoV2 die Immunität gegen eine erneute Infektion anhält.

Antikörper werden meistens mittels indirektem ELISA quantifiziert. Andere Formate wie Schnelltests geben nur qualitative (ja/nein) Ergebnisse. Bei SARS-CoV2 ist problematisch, dass viele andere, mehr oder weniger verwandte Coronaviren zu den Erregern der gewöhnlichen saisonalen Erkältungskrankheiten gehören. Die Herausforderung besteht also darin, ein Antigen auszuwählen, das nur Antikörper gegen SARS-CoV2 und nicht kreuzreagierende Ak gegen andere Coronaviren erkennt. Die Beschreibung eines Testsystems finden Sie hier. Bei einigen bereits verfügbaren kommerziellen Tests scheint die Forderung nach Spezifität nicht erfüllt zu sein.

 

Replikation von SARS-CoV2

SARS-CoV2 bindet mit seinem Spike-Glykoprotein an das Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2), das auf der Zelloberfläche vorliegt. Nach der Bindung wird das Spike-Protein durch körpereigene Proteasen gespalten, das Virus von der Zelle aufgenommen und liegt an in Endosomen vor. Aus den Endosomen/Lysosomen wird das Genom des Virus, ein einzelner RNA-Strang in (+)-Orientierung, ins Cytoplasma freigesetzt. Aus diesem RNA Strang wird direkt, ohne Umweg über DNA, wieder ein neuer komplementärer RNA Strang synthetisiert. Dazu wird eine virale RNA-abhängige RNA Polymerase (RdRp) benötigt, die in nicht virusinfizierten Zellen nicht vorkommt. Nachdem genügend virale Proteine für die Bildung des Capsids hergestellt wurden, bilden sich neue Virionen und verlassen die Wirtszelle.

Experimentelle Wirkstoffe

Chloroquin
Hydroxychloroquin

Chinolin-Derivate

Chloroquin (Handelsname Resochin) ist ein relativ alter Wirkstoff, der von der Firma Bayer hergestellt und seit rund 80 Jahren zur Therapie und Prophylaxe gegen Malaria eingesetzt wurde. Andere Einsatzgebiete sind Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis und Lupus erythematodes.

In Zellkultur-Versuchen zeigte sowohl Chloroquin als auch dessen Metabolit Hydroxychloroquin (Handelsname Quensyl) Wirkung sowohl gegen das alte SARS Coronavirus als auch gegen SARS-CoV2, den Erreger von COVID-19. Einer der Wirkmechanismen dürfte dabei die Veränderung des pH-Werts in den Lysosomen sein, daneben scheint auch die Endozytose und damit die Aufnahme des Virus möglicherweise gehemmt zu werden. In ersten Behandlungsversuchen an Patienten zeigten sich widersprüchliche Ergebnisse. Auch wegen der zahlreichen, teilweise schweren Nebenwirkungen dieser Wirkstoffe bei den erforderlich hohen Dosierungen stehen die Zulassungsbehörden in Europa, aber auch in den USA, einem breiten Einsatz kritisch gegenüber, solange keine besser abgesicherten klinischen Daten vorliegen. Die französische Zulassungsbehörde hat ausdrücklich vor bestimmten Kombinationen gewarnt. Der gegenwärtige Präsident der USA hatte den Wirkstoff zuvor sehr stark beworben und als „möglicherweise größten Durchbruch der Medizin“ bezeichnet.In diesem Zusammenhang wurde auch die Kombination mit Azithromycin propagiert. Dieses Makrolid-Antibiotikum, das die Proteinsynthese an bakteriellen Ribosomen blockiert, ist jedoch gegen Viren unwirksam.

Remdesivir

Dieser Wirkstoff, der von der Firma Gilead Sciences synthetisiert und bei der Ebola-Epidemie versuchsweise angewendet wurde, ist ein Prodrug der eigentlichen Wirkform GS-441524. Die Wirkform ist ein C-Nukleosid, das ein Analogon des Adenosins darstellt. In vivo wird das Nukleosid zum Triphosphat phosphoryliert. Der Wirkmechanismus besteht in der Hemmung der RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp), wodurch die Replikation des Virus gehemmt wird. In vitro zeigte der Wirkstoff breite Aktivität gegen eine Reihe von (+)-Strang RNA.Viren, u.a. auch gegen Orthomyxo- (Influenza) und Paramyxo-(Parainfluenza) Viren und einige andere. Bei der Ebola-RdRp bewirkt der Einbau des Remdesivirtriphosphats in das RNA-Primärtranskript einen verzögerten Kettenabbruch, vorwiegend an der Position i+5.

Obwohl Remdesivir gegen Ebola nur mäßig wirksam war, wird es derzeit als aussichtsreichster Kandidat angesehen und seit März 2020 weltweit in mehreren klinischen Phase 3 Studien zur Behandlung von COVID-19 eingesetzt. Der Hersteller hat zugesagt, bis Ende 2020 ausreichende Mengen zur Behandlung von mehr als einer Million Patienten herstellen zu können.

Seit 03.07.2020 ist Remdesivir in der EU zur Behandlung einiger Formen von COVID-19 zugelassen.

Remdesivir
GS-441524

Proteaseinhibitoren

Die meisten Proteine des SARS-CoV2 Virus werden nicht getrennt voneinander translatiert, sondern entstehen aus einem großen Vorläuferprotein, das durch eine virale Protease in die verschiedenen funktionellen viralen Proteine gespalten wird. Dieser Spaltungsvorgang ist essentiell. Die Hemmung viraler Proteasen hat sich bei der Therapie verschiedener Viruserkrankungen bewährt, besonders bei der Therapie von HIV. Dort wird oft eine Kombination zweier Proteaseinhibitoren (Lopinavir und Ritonavir, Handelsname Kaletra) eingesetzt. In vitro ist diese Kombination auch gegen SARS-CoV2 wirksam, in einer ersten klinischen Studie wurde allerdings keine signifikante Verbesserung bei der Behandlung mit dieser Proteaseinhibitor-Kombination beobachtet.

Lopinavir
Ritonavir

Dexamethason

Dexamethason ist ein synthetisches, fluoriertes Glucocorticoid das etwa 30mal so stark wirkt wie das natürliche Hydrocortison. Es wird seit mehr als 50 Jahren klinisch eingesetzt. Wie alle Glucocorticoide unterdrückt Dexamethason Entzündungsreaktionen, so auch den Zytokinsturm, der bei schwerem Verlauf der Covid-19 Infektion auftritt. Obwohl Dexamethason nicht kausal wirkt, also die Replikation des Virus nicht hemmt, senkt es die Sterblichkeit um etwa ein Drittel und wirkt damit einigen Studien zufolge besser als Remdesivir.

Andere Wirkstoffe

Favipiravir ist in Japan zur Behandlung der Influenza zugelassen, in China wird der Stoff als wirksam bei COVID-19 angesehen.

Das Zytokin Interferon β-1a wirkt auf das Immunsystem und wird ebenfalls experimentell eingesetzt.

Der Proteaseinhibitor Camostat, der zur Therapie der Pankreatitis (Entzündung der Bauchspeicheldrüse) in Japan zugelassen ist, blockiert auch die körpereigene Protease TMPRSS2, die beim Eindringen des Virus in die Zelle benötigt wird.

Favipiravir

Eine Zusammenfassung anderer Wirkstoffe und Wirkstoffkombinationen, die gegenwärtig experimentell gegen SARS-CoV2 eingesetzt werden, finden Sie hier (wird laufend aktualisiert))